探索未知世界的钥匙:RNA修饰图谱

RNA修饰概述表观遗传学领域正在形成许多全新的、令人兴奋的分支。其中之一便是RNA修饰研究领域。最近的RNA修饰检测和测序方法的开发进展(例如,miCLIP)表...


RNA修饰概述

表观遗传学领域正在形成许多全新的、令人兴奋的分支。其中之一便是RNA修饰研究领域。最近的RNA修饰检测和测序方法的开发进展(例如,miCLIP)表明,发现各种细胞类型或模式生物中新的修饰并将这些修饰定位至不同种类的RNA正变得更加容易和快速。这一技术的进展使得已知的RNA修饰的数量剧增。

目前,已有 100 多种已知的RNA化学修饰,包括m6A、m1A 和m2,2G。您可以在mRNA、tRNA、rRNA 和miRNA 等其他非编码RNA中发现这些RNA化学修饰。每一种修饰各有其功能,包括RNA结构、输出、稳定性和mRNA剪接。该研究领域的前景一片光明;关于这些新的、令人兴奋的修饰的功能,还有许多等待着我们去发现。

一种基于抗体的用于定位全转录组中m6A和m6Am的新方法。

康奈尔大学Samie Jaffrey实验室最近发表的一篇论文中提出了一种在真核生物RNA中高分辨率定位N6-甲基腺苷的新方法,称为m6A单核苷酸分辨率交联与免疫沉淀 (miCLIP) 法。

虽然m6A是真核生物mRNA中最丰富的修饰碱基,但利用现有方法对其进行准确研究仍存在局限性。高分辨率定位m6A的新方法对了解这种表观遗传学RNA修饰至关重要。

Abcam的m6A相关抗体

miCLIP 法

1. 使用 Trizol 从HEK293细胞系(人)或肝细胞核(小鼠)中提取RNA。

2. 将RNA 片段化为30-130的核苷酸长度,与抗-m6A抗体共孵育。

3. 通过紫外使RNA和抗体交联。

4. 使用蛋白质A/G亲和纯化、SDS-PAGE和硝酸纤维素膜转印回收抗体-RNA复合物。

5. 接头连接,使用蛋白酶 K释放RNA。

6. 将 RNA逆转录为cDNA,进行PCR扩增并测序。

7. 鉴定C-T转换或截短,与已知的基因组序列进行对比。定位鉴定为m6A/m6Am残基的结合位点,并在转录组中标注。

修改自 Linder et al.(2015) Nature Methods 12:767–772

miCLIP 的原理

通过交联RNA-m6A抗体结合位点,在抗体结合的RNA进行逆转录时,这些特异性位点上将发生突变。

对这种独有的突变特征(例如,C-T转换或截短)进行测序可精确定位m6A

现有m6A检测方法的挑战

现有的MeRIP-seq或m6A-seq技术使用IP和m6a特异性抗体,然后对100个左右的核苷RNA片段进行测序。

该方法有两个主要的局限:

1.该方法不能鉴定修饰残基的精确位置,只能确定m6A位点的大致位置,

2.生物信息学m6A检测中的偏差-----先假设基于已知的包含m6A残基的共有序列,因此忽略了这些基序之外的修饰。

研究人员通过引入重亚硫酸盐测序解决了DNA甲基化检测中面临的相同问题,该方法通过重亚硫酸钠处理来区分修饰和未修饰的胞嘧啶残基。由于m6A和未修饰腺苷酸之间缺乏可区分的化学特性,因而无法使用相似的方法定量m6A。

miCLIP的优势和应用

miCLIP能对单个m6A残基进行高分辨率检测并对整个RNA进m6A聚类分析。使用miCLIP,研究人员能够定位人和小鼠mRNA中单核苷酸分辨率水平的m6A和相关的二甲基化形式的m6Am(N6,2′-O-二甲基腺苷)。

此外,miCLIP的发展为m6Am修饰提供了新见解,该修饰发生在5'端转录起始位点。这促进了对 RNA中这种知之甚少的独有的表观遗传学特征的功能的研究。

研究人员还证实,miCLIP适用于更小的RNA。他们发现m6A存在于小核仁RNA (snoRNA) 等一类小型非编码RNA中。由于缺乏特异性以及生物信息学面临的挑战,这在以前的应用中是不可能发现的。

发展趋势

对miCLIP与以往方法的全面验证表明,miCLIP是一种高灵敏度工具,可精确定位真核生物转录组中的m6A和m6Am RNA修饰。

如果能获得特异性的抗体,这种基于抗体的技术很可能被广泛应用于RNA上发生的其他表观遗传学修饰中。 

这一进展可能会打开高分辨率表观遗传定位和揭示RNA机制的表观遗传控制的新世界。

过去的方法使用抗体免疫沉淀(使用m6A特异性抗体)检测和定位RNA中的m6A并对100个左右的核苷酸RNA片段进行测序,这种方法被称作m6A-seq或MeRIP-seq。该方法只能确定 m6A位点的大致位置,不能精确鉴定修饰残基的特定位置。

生物信息学m6A“检测”中的偏差是该技术的另一个局限。先验假设基于已知的包含m6A残基的共有序列,因此忽略了这些基序之外的m6A。

更大的挑战是m6A和未修饰腺苷碱基之间缺乏可区分的化学结构。与此不同的是,DNA甲基化可以通过重亚硫酸盐处理,在未修饰的碱基上插入一个新碱基,从而区分修饰和未修饰的胞嘧啶残基,但使用该方法无法定量m6A。

参考文献

  • Dominissini, D. et al.(2012). Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature 485, 201–206

  • Liu, N. et al.(2015). N6-methyladenosine-dependent RNA structural switches regulate RNA–protein interactions.Nature 518, 560-564

  • Narayan, P. and Rottman, F.M.(1988). An in vitro system for accurate methylation of internal adenosine residues in messenger RNA.Science 242, 1159–1162

  • Meyer, K.D. and Jaffrey, S.R.(2014) The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control.Nat Rev Mol Cell Biol 15, 313–326

  • Sugimoto, Y. et al.(2012).Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions.Genome Biol.13, R67

  • Wang, X., Lu, Z., Gomez, A., Hon, G.C., Yue, Y., Han, D., Fu, Y., Parisien, M., Dai, Q., Jia, G., et al.(2014).N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.Nature 505, 117-120

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